试验设计

小鼠的分组与处理：选择5周龄C57/BL6J 雄性小鼠40只，于18~24℃光暗各12 h环境下饲养，适应性喂饲7 d后，随机分为低脂饮食对照组（LFD组）、高脂饮食模型组（HFD组）、高脂饮食+低剂量XOS干预组（XOS.L组）、高脂饮食+高剂量XOS干预组（XOS.H组）4组，每组10只。LFD组和HFD组分别喂饲脂肪含量10%的低脂饲料和脂肪含量60%的高脂饲料，XOS.L组和XOS.H组小鼠在HFD组基础上分别灌胃0.35和1.0 g/kg的XOS（将0.35 g和1.0 g的XOS分别溶于10 mL生理盐水中），每日1次；LFD 组、HFD组小鼠灌胃等剂量生理盐水，所有小鼠共灌胃16周，每日记录小鼠进食量，每日测量小鼠体质量。

小鼠血生化指标的检测及肝脏的组织学评估：第16周时，小鼠禁饮食12 h后，腹腔麻醉，眼球取血，分离血清，使用自动生化分析仪检测小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、三酰甘油（TG）含量。采血后断颈处死小鼠，立即剥离出小鼠的肝脏组织；收集小鼠近段结肠内的新鲜粪便，液氮冷冻后于冰箱-80℃保存，备用。各组小鼠分别取1/4肝脏组织，用4%多聚甲醛固定24 h之后，石蜡包埋后切片，洗脱石蜡后切片行苏木素-伊红（HE）染色；另取各组小鼠1/4肝脏组织于4%多聚甲醛固定24 h后，OCT包埋后切片，洗脱OCT后行油红O染色。由2位经验丰富的病理学专家对各组小鼠肝脏的 HE染色切片，通过光学显微镜进行组织学评估，评分标准参照SAF评分系统。

16S rRNA基因测序和数据分析：取各组小鼠的新鲜粪便样本，使用DNA抽提试剂盒提取粪便中的基因组DNA，以16S rRNA为聚合酶链式反应的扩增靶向引物行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测扩增产物的DNA浓度并将其纯化后，通过上海欧易生物医学科技有限公司的Illumina MiSeq平台进行测序。将所获得的测序数据，通过FLASH软件进行拼接、序列质控后得到有效序列，使用Vsearch软件将有效序列归类为多个可操作分类单元（OTUs）。通过Muscle（versionv.1.30）软件对各组基于OUTs结果的小鼠肠道菌群种类进行α多样性分析，获得代表肠道菌群种类多样性的Shannon指数，使用R语言工具绘制各组菌群种类多样性的分布热图和箱式图；通过多变量主坐标分析（PCoA）对各组小鼠肠道菌群丰度的β多样性进行分析，即基于欧式距离算法和95%置信区间，来分析各组肠道菌群的距离尺度，得到横坐标（PC1）和纵坐标（PC2）的PCoA图。通过MetaStats分析各组小鼠肠道菌群在科水平和属水平相对丰度，并进行比较，获得各组间差异较大的肠道菌群。

小鼠粪便代谢组学分析：取各组小鼠的新鲜粪便样本，经PBS预处理后，采用液质联用系统（由Nexera UPLC超高效液相串联QE高分辨质谱仪组成）分析在ESI正离子和负离子模式下的粪便代谢谱。通过Proteo Wizard软件把粪便代谢谱的原始数据转化成 mzXML格式，然后应用Progenesis QI v2.3软件处理质谱数据。将处理好的数据通过正交偏小二乘判别分析（OPLS-DA）模型来区分各组小鼠代谢谱的差异。为了验证该模型的可靠性，采用置换验证对其进行200次置换检验。

差异代谢物获取与通路富集分析：将从各组小鼠粪便中分析得到的粪便代谢谱数据，利用R语言中的Metabo Analyst R包，以P<0.05且VIP>1为筛选条件进行代谢物差异分析。将获得的差异代谢物导入Metabo Analyst 5.0 平台，再使用KEGG Compound数据库对差异代谢物进行通路富集分析，比较差异代谢物在共同通路中的富集强度。采用 Speraman方法对各组小鼠的差异肠道菌群与差异代谢物进行相关性分析，以获得肠道菌群与代谢物之间的相互关系。

试验结果

（1）各组小鼠血清指标及肝脏组织学比较

由表1可知，单因素方差分析结果显示，4组小鼠血清中ALT、AST、TG水平及肝脏SAF评分比较差异均有显著性（F=39.17~113.80，P<0.05）。其中与LFD组比较，HFD 组血清ALT、AST、TG水平及SAF评分均显著增高（t=8.26~15.68，P<0.05）；与HFD组比较，XOS.L组和 XOS.H组小鼠上述各项指标均显著降低（t=5.89~12.19，P<0.05）；XOS.H组较XOS.L组小鼠上述各项指标均显著降低（t=2.37~3.79，P<0.05）。

如图1所示，肝脏组织切片HE染色显示，LFD组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞排列较为整齐，肝索呈放射状排列，无明显纤维化；XOS.H组小鼠肝小叶结构基本正常，肝索排列尚整齐，轻度纤维化；XOS.L组小鼠肝小叶结构紊乱，肝索排列不齐，部分肝细胞气球样变，纤维化较XOS.H组重；HFD组小鼠肝脏损伤严重，肝小叶结构模糊，肝细胞肿胀、肝索排列紊乱，有大量气球样变，明显纤维化。油红O染色显示，LFD组肝脏组织切片几乎无油红着色，XOS.H组有轻微着色，XOS.L组着色较LFD组、XOS.H组深，但比HFD组轻，而HFD组小鼠肝脏内着色均较余3组明显。

（2）小鼠肠道菌群多样性分析

如图2A所示，α多样性分析的结果显示，LFD组、HFD组、XOS.L组、XOS.H组小鼠肠道菌群种类多样性均未见显著性差异（P>0.05），Shannon指数分别为5.81±0.94、6.07±0.85、6.13±0.61、6.25±0.37，各组间比较差异无显著性（P>0.05）；同时通过Shannon指数所绘制的箱式图也呈窄、扁形状，见图2A，说明各组Shannon指数值相对稳定。

如图2B所示，β多样性分析的结果显示，图中4组肠道菌群丰度以4种不同的颜色的符号表示，以95%置信区间将各组肠道菌群丰度进行聚类，显示HFD组与LFD组、XOS.L组和XOS.H组椭圆重叠度均较低，说明HFD组与余3组的菌群丰度差异较大；LFD组、XOS.L组和XOS.H组椭圆重叠度较高，说明这3组菌群丰度差异较小；XOS.H组与LFD组椭圆重叠度最高，说明这两组的肠道菌群丰度差异最小。

MetaStat分析结果显示，在属水平方面，4组小鼠中肠道菌群相对丰度均较高的属分别为Bacteroides、Parabacteroides、Faecalibaculum、Alistipes、Colidextribacter、Oscillibacter、Coriobacteriaceae_UCG_00等。其中与LFD组相比较，HFD组Bacteroides、Parabacteroides等菌群丰度显著降低（P<0.01），而Faecalibaculum、Alistipes、Colidextribacter、Oscillibacter等菌群的丰度显著升高（P<0.05）；与 HFD组相比，XOS.H组Actinobacteria、Coriobacteriia、Coriobacteriaceae_UCG_002等菌群丰度显著降低（P<0.05）；XOS.L组与其余三组比较，各菌群丰度差异不明显（P>0.05）。科水平方面，4组小鼠中肠道菌群相对丰度均较高的科分别为Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Ruminococcaceae等。与LFD组相比，HFD组Ruminococcaceae、Erysipelatotrichaceae、Lachnospiraceae、Oscillospirace等菌群的丰度显著升高（P<0.05），Bacteroidaceae、Muribaculaceae、Prevotellaceae等菌群的丰度显著降低（P<0.05）；与HFD组相比，XOS.H组Ruminococcaceae、Atopobiaceae、Bacteroidaceae、Faecalibaculum、Erysipelatotrichaceae等菌群丰度显著降低（P<0.05），Bifidobacterium、Alloprevotella、Prevotellaceae等菌群丰度显著升高（P<0.01）；XOS.L组较其余的3组仅Fusobacterium、Erysipelatotrichaceae菌群的丰度显著降低（P<0.05）。

（3）各组小鼠粪便差异代谢物分析

在OPLS-DA模型中，4组小鼠粪便差异代谢物的分布明显分离，互不重叠，说明 OPLS-DA模型无过度拟合，稳定性良好，对粪便代谢物差异性分析的评价结果可靠度高。同时对模型经200次置换检验后，显示R²=0.97，Q²=-0.2，R²表示模型的拟合情况，其值接近1.0，证明模型的稳定性好；Q²为模型的预测指数，其值为负值，证明模型的预测能力可靠。

对小鼠粪便代谢物分析显示，HFD组与LFD组比较有117种上调，66种下调（VIP=1.0~2.0，P<0.05）；XOS.L组与HFD组比较有84种上调，77种下调（VIP=1.0~3.0，P<0.05）；XOS.H组与HFD组比较有247种上调，91种下调（VIP=1.0~1.5，P<0.05）；XOS.H组与XOS.L组比较有100种上调，15种下调（VIP=0.5~2.5，P<0.05）。各组间两两比较得到的最显著的差异代谢物包括前列腺素H2（PGH2）、前列腺素D2（PGD2）、白三烯B4（LTB4）、△12-前列腺素J2（△12-PGJ2）、亚油酸（LA）、二十二碳五烯酸（DPA）等。

（4）各组差异代谢物 KEGG 通路富集分析

分析结果显示，4组小鼠的差异代谢物在花生四烯酸代谢途径、LA代谢途径、不饱和脂肪酸代谢途径中均发生显著富集，其中，HFD组较LFD组△12-PGJ2、PGH2等差异代谢物富集强度显著上调（P<0.001），PGD2等差异代谢物富集强度显著下调（P<0.05），XOS.H组较HFD组的PGH2富集下调，而PGD2以及不饱和脂肪酸LA、DPA富集强度显著上调（P<0.01），XOS.L组较HFD组仅DPA、PGD2的富集强度上调（P<0.01）。

（5）各组小鼠肠道菌群与差异代谢物相关性分析

Spearman相关性分析显示，差异代谢物PGH2与Alistipes、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium 等的丰度呈正相关性（P<0.01），同时与Lachnospiraceae_NK4A136_group、Allobaculum、Faecalibaculum 的 丰 度 呈 负 相 关 性（P<0.05）。PGD2与 Lachnospiraceae_NK4A136_group 的丰度呈正相关（P<0.05），而与Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium 以及Alistipes的丰度呈现负相关（P<0.01）。△12-PGJ2与Colidextribacter 的丰度呈正相关性（P<0.01），与 Bacteroides、Alloprevotella 丰度呈负相关（P<0.01）。同时LA与Lachnospiraceae_NK4A136_group、Oscillibacter、Colidextribacter的丰度呈正相关（P<0.05），与Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ileibacterium、Lactobacillus、[Eubacterium]_fissicatena_group的丰度呈负相关（P<0.05）。另外DPA与Lachnospiraceae_NK4A136_group的丰度呈正相关（P<0.001），而与Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ileibacterium、Lactobacillus、Alistipes的丰度呈负相关（P<0.05）。

试验结论

本研究通过对高脂饮食致脂肪肝（FLD）模型小鼠的组织病理特征分析显示，XOS的干预可显著降低FLD小鼠血液中的ALT、AST、TG水平，改善肝细胞内的脂滴堆积及肝细胞水肿，显著降低肝细胞损伤；对小鼠肠道菌群及代谢物的HEGG通路分析显示，XOS可能通过花生四烯酸代谢、亚油酸代谢及不饱和脂肪酸代谢等途径调节PGH2、PGD2、LA以及DPA等代谢物水平，进而影响肠道菌群Lachnospiraceae_NK4A136_group、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium等科到属水平及其肠道代谢物的变化，从而改善FLD小鼠肝脏脂肪样变，延缓肝损伤进展。因此XOS作为益生元可能具有改善高脂饮食所致脂肪肝的效果。

参考资料：

李翰卿,李宇鹍,张震,等.低聚木糖对高脂饮食致脂肪肝小鼠的保护作用及其机制[J].精准医学杂志,2024,39(02):108-113+119.